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ames试验

发布时间:2021-12-30 15:06:21

Ames鼠伤寒沙门氏杆菌回复突变试验-ISO 10993-3, GB/T 16886.3, YY/T 0127.10

Ames试验全称鼠伤寒沙门氏杆菌回复突变试验。
实验目的和原料:
鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)的组氨酸营养缺陷型(his-)菌株,在含微量组氨酸的培养基中,除极少数自发回复突变的细胞外,一般只能分裂几次,形成在显微镜下才能见到的微菌落。受诱变剂作用后,大量细胞发生回复突变,自行合成组氨酸,发育成肉眼可见的菌落。某些化学物质需经代谢活化才有致变作用,在测试系统中加入哺乳动物微粒体酶,可弥补体外试验缺乏代谢活化系统之不足。

应用标准

ISO 10993-3, GB/T 16886.3, YY/T 0127.10

Ames试验的常规方法有斑点试验和平板掺入试验。

1.菌株鉴定
用于测试的菌株,需经基因型和生物学性状鉴定,符合要求才能投入使用。
目前推荐使用的一套菌株是TA97、TA98、TA100和TA102。鉴定前先进行增菌培养。为鉴定结果可靠,需同时培养野生型TV菌株,作为测试菌基因型之对照。增菌培养用牛肉膏蛋白胨液体培养基,接种后于37℃,100r/min振荡培养12h左右,细菌生长相为对数期末,含菌数应为1×109个/ml~2×109个/ml。
鉴定项目:
(1)脂多糖屏障丢失(rfa)用接种环或一端挠起的接种针以无菌操作术取各菌株的增菌培养液,在营养琼脂平板上分别划平行线,然后用灭菌尖头镊夹取灭菌滤纸条,浸湿结晶紫溶液,贴放在平板上与各接种平行线垂直相交。盖好皿盖后倒置于37t温箱,培养24h后观察结果。
(2)R因子 划线接种,贴放滤纸条及培养等均同上,唯滤纸条浸湿的药液不同,为氨苄青霉素钠溶液。TA102除pKM101外,还有pAQ1,载有抗四环素的基因,故另用滤纸条浸湿四环素溶液后贴放于划线接种的平板上。
(3)紫外线损伤修复缺陷(△uvrB)在营养琼脂平板上按上述方法划线接种后,一半接种线用黑玻璃遮盖,另一半暴露于紫外光下8sec,然后盖好皿盖并用黑纸包裹平皿,防止可见光修复作用。培养同上。
(4)自发回变 预先制备底平板;向灭菌并在水浴内保温45℃的上层软琼脂中注入0.1ml菌液;混匀后倾于底平板上并铺平。平皿倒置于37℃温箱培养48h。
(5)回变特性——诊断性试验 上层软琼脂中除菌液外,还注入已知阳性物之溶液,需活化系统者并加入S9mix,余同上。
组氨酸营养缺陷型由自发回变即可知。
2.斑点试验
吸取测试菌增菌培养后的菌液0.1ml,注入融化并保温45℃左右的上层软琼脂中,需S9活化的再加0.3ml-0.4mlS9mix,立即混匀,倾于底平板上,铺平冷凝。用灭菌尖头镊夹灭菌圆滤纸片边缘,纸片浸湿受试物溶液,或直接取固态受试物,贴放于上层培养基的表面。同时做溶剂对照和阳性对照,分别贴放于平板上相应位置。平皿倒置于37℃温箱培养48h。在纸片外围长出密集菌落圈,为阳性;菌落散布,密度与自发回变相似,为阴性。
3.平板掺入试验
将一定量样液和0.1ml测试菌液均加入上层软琼脂中,需代谢活化的再加0.3ml-0.4ml S9mix,混匀后迅速倾于底平板上铺平冷凝。同时做阴性和阳性对照,每种处理做3个平行。试样通常设4个~5个剂量。选择剂量范围开始应大些,有阳性或可疑阳性结果时,再在较窄的剂量范围内确定剂量反应关系。培养同上。同一剂量各皿回变菌落均数与各阴性对照皿自发回变菌落均数之比,为致变比(MR)。MR值≥2,且有剂量-反应关系,背景正常,则判为致突变阳性。

周期

测试周期如下表所示:

产品

测试周期

医疗器械

6-8周,详情请联系

药物

6-8周,详情请联系


送样要求

ISO 10993-3标准:固体或粉末状: 3个完整样品,每个样品需60 cm2 或 4 g及以上; 液体或化学品:15ml及以上

GB/T 16886.3标准:固体或粉末状: 3个完整样品,每个样品需60 cm2 或 4 g及以上; 液体或化学品:15ml及以上

YY/T 0127.10标准: 固体或粉末状: 3个完整样品,每个样品需60 cm2 或 4 g及以上; 液体或化学品:15ml及以上



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