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致畸试验

发布时间:2021-12-30 15:05:55

染色体畸变试验-ISO 10993-3, GB/T 16886.3, OECD 473

可用末梢血淋巴细胞,或人和哺乳动物体细胞系作为材料,常用的体细胞系有中国地鼠卵巢细胞(CHO),中国地鼠肺成纤维细胞(V79和CHL),人胚肺2倍体成纤维细胞等。这里介绍外周血淋巴细胞为对象的染色体畸变的试验方法。

实验目的和原理:
染色体畸变分为染色体结构畸变和数目畸变,染色体结构畸变又分为缺失、短片、互换等。
在加入和不加入代谢活化系统的条件下,使培养的哺乳动物细胞暴露于受试物中,用中期分裂相阻断剂(如秋水仙素或秋水仙碱)处理,使细胞停止在中期分裂相,随后收获细胞,制片,染色,分析染色体畸变。

应用标准

AAMI/ANSI/ISO 10993-3,  GB 16886.3 , OECD 473

方法与步骤  

1. 试剂 
1)RPMI-1640培养液,含20%小牛血清。  
2)肝素:每支含肝素12500U,使用时用生理盐水配成500U/ml,4℃冰箱内保存备用。 
3)秋水仙素:配成40ug/ml浓度。称取秋水仙素4mg,溶解于100ml 0.85%Nacl 溶液中,经6号细菌漏斗过滤,4℃冰箱内保存。使用时吸取0.05或0.1ml加入到5ml细胞培养物中,其终浓度为0.4~0.8ug/ml。 
4)双抗:青霉素100U/ml,链霉素100ug/ml。 
5)PHA:PHA为冰干注射剂(广州生产)每支10mg,使用时用2ml生理盐水溶解。 
6)KCl低渗液:KCl 1.88g,双蒸水1000ml使之溶解,其浓度为0.025M.
7)冰醋酸甲醇固定液:冰醋酸1份,甲醇3份,混合而成。 
2. 细胞培养 常规细胞培养 
3. 受试物的处理 
实验分组:至少设立五个组,即阳性对照、阴性(溶剂)对照及三个剂量组。最高剂量和最低剂量之间相差10倍,中间再设一个剂量,阳性对照物为已知的染色体断裂剂,如丝裂霉素C(MMC),剂量为0.02μg/ml;黄曲霉素毒素B1,浓度为10-6M等。每组中应设2~3个平行样品。  
4. 操作步骤  
1)收集细胞:经受试验处理的细胞,培养开始后52~72h收集细胞。依不同受试物而有所差异。  2)加入秋水仙素:培养终止前于培养物中加入40μg/ml秋水仙素0.05-0.1ml,终浓度为0.4~0.8μg/ml,37℃下培养4h。 
3)低渗处理:小心取出细胞培养物,弃去上清液,细胞沉淀在瓶底(体细胞须经胰酶消化),加入8ml KCl低渗液,用滴管轻轻吹打制成细胞悬液,移入10ml刻度离心管中,37℃下处理20min。  4)离心:1000转/min,离心7~10min,弃去上清液,收集细胞,加入Hanks液。 
5)固定:加入1:3冰醋酸甲醇固定液3ml预固定,用滴管轻轻吹打,立即离心,收集细胞,再加入10ml上述固定液,处理15min,反复操作两次,每次15min。 
6)制片:弃去固定液,再加入适量新鲜固定液,混匀。取出预冷的载玻片,每片滴加1~2滴细胞悬液,用嘴轻轻吹散,或用滴管吸取少许细胞悬液,在40~50㎝高度上对准下面玻片滴加悬液,以冲力使细胞分散。自然干燥或用微热电吹风机吹干,也可在酒精灯火焰上略加烘烤。此时可在显微镜下检查有无分裂相细胞。 
7)染色:用Giemsa 染液染色15min,用自来水轻轻冲洗残留染液,待干。  
8)镜检:先在低倍镜下寻找分散良好的分裂相细胞,然后用高倍镜或目镜观察,进行染色体畸变计数,分析,分别记录染色体畸变细胞数及各种类型染色体畸变细胞数,选择良好的典型的染色体畸变图进行显微照相。  
5. 结果表示 
1)染色体总畸变率及畸变率:     总畸变率(%)=各种畸变类型数/分析总细胞数×100         畸变率(%)=染色体畸变数/染色体总数×100  
2)畸变类型分析:包括断片(F)、双着丝粒(D)、环(R)、互换(E)等,电力辐射常见断片、双着丝粒、环等,而化学毒物常见单体断裂。
6. 注意事项  
1) 接种的血样要新鲜,如不立即培养,应放在4~25℃温度下,于24h内作培养。
2) 培养箱温度以37±5℃为宜。  
3) 培养过程中如发现血样凝集,可将培养瓶轻轻震荡,使凝块散开,然后继续培养。
4) 如低渗处理不当,染色体聚集一团,可将固定时间延长数小时或过夜,热低渗过度,往往细胞全部破碎,造成染色体丢失。
5) 离心速度过快,细胞团不易打散,速度过低,则使分裂相细胞大量丢失。 
6) 玻片要严格清洁,使细胞均匀铺开。

周期

测试周期如下表所示:

产品

测试周期

医疗器械

6-8周,详细请联系

药物

6-8周,详细请联系

药物接触材料

6-8周,详细请联系


送样要求

ISO 10993标准: 固体或粉末状: 6个完整样品,每个样品需60 cm2 或 4 g及以上; 液体或化学品:25ml及以上


GB 16886标准:  固体或粉末状: 6个完整样品,每个样品需60 cm2 或 4 g及以上; 液体或化学品:25ml及以上


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